構建標準曲線：為絕對定量確立標尺

標準曲線是實現絕對定量的基礎，其核心是建立已知拷貝數與檢測信號（Ct值）之間的精確對應關系。構建一條高質量的標準曲線，需遵循以下關鍵步驟：

1. 制備高純度標準品：首先，需要合成或制備已知序列的目標miRNA，并通過精確的濃度測定（如紫外分光光度法）和拷貝數換算，獲得初始標準品。

2. 進行梯度稀釋：將標準品按等比例（如10倍）進行系列稀釋，通常至少設置5-7個濃度梯度，覆蓋樣本中目標miRNA可能的表達范圍。稀釋過程必須精準且一致，避免產生誤差累積。

3. 執行qPCR反應：將每個梯度的標準品作為模板，在相同的反應條件下進行熒光定量PCR檢測，記錄每個濃度的Ct值。

4. 繪制與評估標準曲線：以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，測得的Ct值為縱坐標，繪制標準曲線。評估曲線質量的關鍵指標包括：

   • 相關系數（R²）：反映曲線的線性關系，理想的R²應大于0.99，越接近1，說明定量越準確。

   • 擴增效率（Efficiency）：由斜率計算得出，理想的擴增效率應在90%-110%之間。效率過高可能提示有引物二聚體干擾，過低則可能反應條件不佳。

待測樣本的Ct值代入這條已驗證的標準曲線，即可換算出其初始模板中目標miRNA的絕對拷貝數或濃度。

篩選內參基因：為相對定量校準偏差

對于大多數基因表達研究，相對定量是更常用的方法，其準確性高度依賴于內參基因的穩定性。內參基因相當于“分子天平”，用以校正樣本間在RNA提取、反轉錄效率上的差異。篩選理想內參基因的策略如下：

1. 選取候選基因：選擇多個在樣本中普遍表達且表達水平相對恒定的miRNA作為候選，如U6 snRNA、SNORD44（又稱RNU44）、SNORD48（又稱RNU48）等，具體選擇需結合樣本類型（如組織、血清、細胞）參考相關文獻。

2. 評估表達穩定性：通過預實驗檢測所有候選基因在實驗各組樣本中的Ct值。理想的穩定內參，其Ct值在不同樣本組間的波動應非常小。

3. 借助算法軟件：單純憑肉眼觀察不夠嚴謹，可借助專門的算法工具（如geNorm、NormFinder、BestKeeper）對候選基因的穩定性進行評分。這些軟件能分析基因的表達變異，推薦最穩的組合。例如，geNorm可以通過計算平均表達穩定值M，篩選出M值低（通常<1.5）的基因。

4. 使用組合內參：為了降低偏差，現代研究常建議使用2-3個穩定內參基因的幾何平均數作為最終的校正因子，這比依賴單個內參更穩健。

總而言之，無論是選擇外參法構建精準的標準曲線，還是篩選穩定的內參基因進行相對定量，其根本目的都是為了在復雜樣本中還原miRNA表達的真實面貌。一套嚴謹的驗證流程，是確保后續所有生物學解讀和結論堅實可信的前提。

 

miRNA熒光定量檢測服務

產品介紹

Real Time PCR，即實時熒光定量PCR，也被稱為定量PCR或qPCR，是一種在DNA擴增反應中，以熒光化學物質測每次聚合酶鏈式反應（PCR）循環后產物總量的方法。通過內參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進行定量分析的方法

由于定量PCR具有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低等優點，被廣泛應用于醫學檢測、藥物療效考核、基因表達研究、轉基因研究、基因檢測、病原體檢測、動植物檢測、食品檢測等各種領域

實驗原理

所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法

實時熒光定量PCR技術類型概述: DNA結合染料法, 基于探針的化學法, 猝滅染料引物法

實驗應用

DNA及RNA定量；基因表達驗證；等位基因鑒別；SNP分型；病原體和病毒檢測；多重PCR

實驗結果